UTILIDAD DE LA PCR RECURSIVA PARA INSERTAR UN APTAMER DE ALTA AFINIDAD EN EL ESPACIADOR MENOR DE CALMODULINA de Trypanosoma cruzi. - Jaén, Luis; Calzada, José; Brandão, Adeilton; Samudio, Franklyn (Tecnociencia, 2021)
Trypanosoma cruzi es el parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Panamá. En este parásito, la regulación de la expresión génica es principalmente un proceso postranscripcional. Se ha sugerido que las proteínas de unión al ARN tienen un papel clave en esta regulación génica. La calmodulina es una proteína sensora de calcio altamente conservada, codificada por tres genes separados por dos espaciadores intergénicos (espaciador mayor y menor). El estudio de las bases moleculares que llevaron a las interacciones ARN-proteínas en T. cruzi podría contribuir a comprender la biología del parásito para desarrollar estrategias novedosas para el control de enfermedades. Desarrollamos una metodología basada en una PCR recursiva para insertar un aptámero de alta afinidad de estreptavidina en la secuencia del espaciador menor, como base para el desarrollo de un sistema de captura de proteínas. La secuencia completa del locus de calmodulina se descargó de GenBank (AAHK01001263.1). La secuencia del aptámero reportadas en publicaciones anteriores (83 pb) se manipuló para el diseño del cebador. Las secuencias se editaron con el software bioinformático UGENE. La secuencia del espaciador menor de calmodulina (CMS) se fragmentó en dos regiones. Los cebadores se diseñaron para flanquear las dos regiones, cada uno con los oligonucleótidos internos directo / inverso unidos a secuencias de medio aptámero. La PCR recursiva final pudo amplificar el espaciador menor de calmodulina incorporando el aptámero. La secuencia fue confirmada por secuenciación de Sanger. La PCR recursiva representa una herramienta útil para insertar secuencias de alta afinidad como aptámeros para estudiar interacciones proteína-ARN específicas.